siPOOLs常見問題解答（FAQ）

1. siPOOLs如何提高基因敲低的特異性和效率？

siPOOL是一款包含30條siRNAs的、高復(fù)雜度的混池，通過降低每條siRNA的實驗相關(guān)性以稀釋其脫靶效應(yīng)。專有的siPOOL設(shè)計算法，可確保較高的轉(zhuǎn)錄本覆蓋率，且避免旁系同源基因，提高基因敲低的效率和特異性。此外，生產(chǎn)的siPOOL包含了規(guī)定長度和高純度的siRNA標準品，從而大大降低非特異性影響的風(fēng)險。

2. siPOOLs與其他市售siRNA池有什么區(qū)別？

其他市售siRNA池要么是3-4個siRNA的低復(fù)雜度混池，要么是不同siRNA長度的隨機混池。相比之下，siPOOLs是一款好用、高復(fù)雜度、確定長度的siRNA混池。

3. 如果我訂購一個siPOOL，總量有多少？我可以用它做多少個反應(yīng)？

對于每個靶基因，siPOOL的規(guī)格有5、10或20 nmol。當(dāng)siPOOL濃度為1nM時，5 nmol至少足夠用于6孔板的2250個孔或者96孔板的45000個孔（參見siPOOL轉(zhuǎn)染方案）。10個及以上的siPOOL批量訂單，可以定制1-2 nmol的小規(guī)格。請聯(lián)系我們獲取定制報價。

4. 從下單到交貨需要多長時間？

我們需要大約3-4周的時間來交付新的siPOOL。而對于已有庫存的siPOOLs，可在2周內(nèi)交貨。根據(jù)序列的不同，某些siPOOLs可能需要更長的時間來合成。我們將會根據(jù)實際情況及時和您溝通是否會延遲交貨。

5. siPOOL可以針對的最小序列長度是多少？

通常，目標基因的特異性序列≥300個堿基就可以設(shè)計siPOOL。在保持種子序列多樣性的條件下，siRNA之間存在一定程度的序列重疊是沒有問題的。請將您的序列信息發(fā)送給我們，經(jīng)過評估后我們會告知您設(shè)計的可行性及建議。

6. 購買siPOOL有什么保證呢？

針對所有編碼基因的siPOOLs均在包含驗證的保證范圍內(nèi)。當(dāng)以高達10nM濃度使用siPOOL，且在轉(zhuǎn)染24小時后做RNA定量檢測分析，我們保證敲低率≥70%。在表達給定靶標的標準細胞系中，陽性對照siRNA應(yīng)獲得最佳的轉(zhuǎn)染條件。如果沒有看到≥70%的敲低率，我們將根據(jù)可用的序列免費為客戶重新設(shè)計、合成、驗證和發(fā)貨一個新的siPOOL。由于敲低效率也會隨著基因的特性而發(fā)生變化，因此使用新的siPOOL能否提高敲低效率，我們無法做出保證。

針對非編碼基因的siPOOL，如果未達到≥60%的敲低率，則根據(jù)可用的序列進行重新合成。不過，驗證和運輸?shù)馁M用需由客戶自己承擔(dān)。

7. 為什么不提供針對長非編碼RNA（lncRNA）的siPOOL驗證？

由于二級結(jié)構(gòu)、結(jié)合蛋白或細胞定位等因素限制了RNAi機制發(fā)揮作用，因此通過RNAi沉默長非編碼RNA（lncRNA）更具挑戰(zhàn)性。根據(jù)可用的轉(zhuǎn)錄序列，我們將提供一輪siPOOL重新設(shè)計和合成，以靶向lncRNA的不同區(qū)域。然而，siPOOL的驗證工作最好還是由熟悉該lncRNA特性的客戶自己開展。

8. 可以提供免費樣品進行測試嗎？

目前，只有0.1 nmol陽性對照（GAPDH / KIF11 / INCENP）和陰性對照siPOOLs可供免費測試。我們歡迎您對經(jīng)常評估的基因提出建議，未來將有可能會將其作為陽性對照。

9. 能否以更低的價格提供較小規(guī)格的siPOOL給到我們進行測試或篩選？

≥ 10個 siPOOLs的批量訂單，可以提供較小的規(guī)格，如1-2 nmol。人激酶siPOOL庫和siPOOL癌癥工具箱中的預(yù)定義siPOOLs也可用于制定較小的規(guī)格。請聯(lián)系我們獲取報價。

10. 對于核定位的RNA，siPOOLs有效嗎？

已經(jīng)有存在于細胞核中的RNAi機制的相關(guān)報道，一些針對核定位RNA（例如MALAT1，XIST）的siPOOLs可以達到70%的敲低效率。然而，細胞質(zhì)定位的RNA可能會更有效地被RNAi靶向。

11. siPOOLs可以組合在一起同時敲低幾個基因嗎？

是的。siPOOLs在低納摩爾濃度下是有效的。這允許在單個應(yīng)用中組合多個siPOOLs，以沉默多個基因，同時將副作用的風(fēng)險大大降低。

在一項研究中，siPOOLs同時成功地沉默多達四個基因的表達 [Welsbie, D. S. et al. Enhanced Functional Genomic Screening Identifies Novel Mediators of Dual Leucine Zipper Kinase-Dependent Injury Signaling in Neurons. Neuron 94(6), 1142–1154.e6 (2017)]。

12. 我應(yīng)該使用什么濃度的siPOOL？

在標準細胞系（例如HeLa，Hek293，A549，MCF7）中，siPOOL通常在借助脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的情況下采用1-3 nM的濃度。在難轉(zhuǎn)染的細胞中，可能需要更高的濃度，并且可以采用電穿孔等替代方法。我們建議先設(shè)置不同的濃度梯度，以確定具有穩(wěn)定敲低效率的較低濃度。對于長期的基因敲低（>3天），建議使用更高的初始siPOOL濃度。另外，我們也可以為您提供劑量優(yōu)化服務(wù)，我們會采用7個濃度梯度進行試驗。如需了解更多信息，請聯(lián)系我們。

13. siPOOL介導(dǎo)的基因敲低效果能持續(xù)多久？

siPOOL敲低基因的持續(xù)時間與其他siRNA相似，取決于細胞系和靶基因。基因敲低效果通常可持續(xù)4-7天。但是，高增殖率的細胞或高活躍度的基因可能會維持更短的時間。通過siPOOLs的再轉(zhuǎn)染或提高siPOOL初始濃度的轉(zhuǎn)染，也許可以延長基因敲低效果的持續(xù)時間。

14. siPOOL可以靶向特定的亞型嗎？

已證明，siPOOL能夠以高特異性和高效率成功地靶向選定亞型。然而，成功概率還取決于該亞型專有的序列可用性。如有需要，請將您的轉(zhuǎn)錄本NCBI ID發(fā)送給我們，我們可以為您作出評估。另外，我們還可為您提供跨亞型或物種選擇性的siPOOL驗證服務(wù)。

15. siPOOL的陰性對照是什么？

我們使用不與人類、小鼠和大鼠基因相互作用的標準陰性對照siPOOL（30個siRNAs）。它已在多個細胞系中進行了測試，對細胞增殖、凋亡或細胞形態(tài)沒有顯著影響。另外，我們也可以根據(jù)需要提供Scrambled陰性對照siPOOL，對靶siRNA序列進行加擾以避免靶標相互作用，同時保持GC含量的百分比（%）。

16. 您的陽性對照siPOOL是什么，讀數(shù)是多少？

陽性對照siPOOL是預(yù)先經(jīng)過驗證的siPOOL，當(dāng)轉(zhuǎn)染細胞時會產(chǎn)生確定的表征，表明轉(zhuǎn)染成功。目前，可用的陽性對照siPOOL所對應(yīng)的基因，包括：人KIF11（3832），可產(chǎn)生有絲分裂停滯和可觀察到的細胞死亡現(xiàn)象；人INCENP (3619)，可產(chǎn)生在顯微鏡下可觀察到的細胞增大表型；人GAPDH（2597），其不產(chǎn)生可觀察到的表型，但通過定量PCR檢測GAPDH的RNA水平時，表現(xiàn)為顯著的下調(diào)。也可提供針對小鼠的GAPDH（14433）和KIF11（16551）的陽性對照siPOOL。

17. siPOOLs可以針對除人類，小鼠和大鼠以外的其他物種嗎？

是的，siPOOLs可以針對任何物種。請向我們提供目標物種、宿主系統(tǒng)和目標序列。

18. siPOOLs的轉(zhuǎn)染條件與其他siRNA有什么不同嗎？

沒有太大的差別。您可以將已經(jīng)優(yōu)化好的siRNA轉(zhuǎn)染條件應(yīng)用于siPOOLs轉(zhuǎn)染中。

19. 有推薦的轉(zhuǎn)染試劑嗎？

市面上的轉(zhuǎn)染試劑種類繁多。對于許多常見的細胞系，采用Lipofectamine的轉(zhuǎn)染效果就很好。然而，原代巨噬細胞或非貼壁細胞等細胞類型的轉(zhuǎn)染可能會存在更多的挑戰(zhàn)。我們可為您提供細胞系轉(zhuǎn)染優(yōu)化服務(wù)，我們將測試3種轉(zhuǎn)染方法。如需了解詳情，請聯(lián)系我們。

20. siPOOL的保質(zhì)期是多久？

siPOOLs在-20°C下儲存時，至少可以穩(wěn)定6個月。盡管我們觀察到siPOOL在保存幾年后仍存在活性，但是，我們推薦您在收到產(chǎn)品后盡快使用，盡量不超過保質(zhì)期。另外，強烈建議您將較大的體積分裝成小體積再進行保存，以避免多次反復(fù)凍融影響實驗結(jié)果。

21. siPOOL可以作為一種可發(fā)表的驗證方法嗎？

是的。siPOOLs不僅可以用于常規(guī)的基因敲低實驗，而且可以作為其他技術(shù)（如CRISPR，單個siRNA或shRNA）的補充驗證方法。在使用siPOOLs進行發(fā)表時，請引用“siTOOLs Biotech"以及Hannus et al., Nucleic Acids Res, 2014文獻。

22. 是否可以進一步的驗證siPOOL，例如：開展回補實驗？

是的。siPOOL敲低效果的進一步驗證，可以采用抗siPOOL回補序列（siPOOL-resistant rescue constructs）來開展，它可以表達siPOOL抗性版本的基因以挽救和恢復(fù)目標基因的功能。

23. 是否需要反卷積一個siPOOL，來單獨測試siRNAs？

我們不建議對siPOOL進行反卷積，因為這會破壞高復(fù)雜性混池化所賦予的高特異性。為了進一步驗證siPOOL結(jié)果，我們建議使用抗siPOOL回補序列。

24. siPOOL以什么形式發(fā)貨？它們在室溫下穩(wěn)定嗎？

siPOOL以懸浮液的形式發(fā)貨（10 nM Tris，pH 8.0）。siPOOL經(jīng)測試可在室溫（RT）下穩(wěn)定至少4周，在37°C下穩(wěn)定1周，在50°C下穩(wěn)定24小時。因此，溫暖氣候條件下的運輸延遲，不太對siPOOL的活性產(chǎn)生不利的影響。

25. siPOOL文庫是否可用于功能基因組篩選？

是的。我們有一個包含505個siPOOLs的siPOOL人類激酶庫，可用于高通量功能基因組篩選，以獲得可靠的RNAi效果。另外，用于RNA結(jié)合蛋白、E3連接酶和去泛素酶的siPOOL文庫，以及其他定制化文庫，請聯(lián)系我們咨詢。