DAP-seq技術(shù)在硝酸鹽誘導(dǎo)百脈根根瘤衰老新機(jī)制研究中的應(yīng)用

豆科植物通過(guò)與根瘤菌共生，形成能夠固氮的根瘤。硝酸鹽能夠影響根瘤共生的過(guò)程，適宜濃度的硝酸鹽促進(jìn)結(jié)瘤固氮，而高濃度的硝酸鹽抑制菌根共生，并且會(huì)促進(jìn)根瘤衰老。NLP (NIN-Like Protein)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控硝酸鹽信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，百脈根NLP1與NLP4的缺失，能夠有效緩解高濃度硝酸鹽對(duì)菌根共生和固氮的抑制作用。然而，NLP調(diào)控根瘤固氮與根瘤衰老的分子機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

2023年3月22日，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)端木德強(qiáng)課題組的最新研究成果，發(fā)表在New Phytologist期刊上(影響因子10.323)，文章題目為“A transcription factor of the NAC family regulates nitrate-induced legume nodule senescence"。該研究使用DNA親和純化測(cè)序(DAP-seq)技術(shù)鑒定了豆科模式植物百脈根中一個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合基序和靶基因，揭示了NAC094在硝酸鹽誘導(dǎo)的根瘤衰老過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，為培育具備高效氮利用特性的農(nóng)作物新品種奠定了重要基礎(chǔ)。

本研究采用高濃度硝酸鹽處理百脈根，對(duì)根瘤樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，與已有的兩個(gè)根瘤早衰突變體轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行聯(lián)合分析，鑒定到一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Lj2g3v1058050，該基因受硝酸鹽誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，并且在早衰根瘤突變體中顯著上調(diào)表達(dá)。該基因編碼一個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子，與擬南芥ANAC094同源，將其命名為LjNAC094。

圖1. NAC094的鑒定與表達(dá)模式分析

對(duì)NAC094的過(guò)表達(dá)株系（NAC094-OE）進(jìn)行表型分析，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)NAC094顯著促進(jìn)了根瘤衰老。過(guò)表達(dá)株系的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，NAC094調(diào)控的基因與硝酸鹽響應(yīng)基因具有高度一致性。

圖2. NAC094過(guò)表達(dá)導(dǎo)致根瘤早衰表型

通過(guò)DAP-seq技術(shù)鑒定了NAC094在全基因組上的調(diào)控靶基因。利用EMSA以及轉(zhuǎn)錄激活實(shí)驗(yàn)對(duì)衰老相關(guān)基因(SAGs)進(jìn)行互作驗(yàn)證。Lysozyme (LYS) 與Cysteine proteases (CYPs) 參與了根瘤衰老過(guò)程中蛋白質(zhì)的降解和細(xì)胞裂解過(guò)程。Copper  transporter (COPT) 和Peptide transporter (PTR) 參與了根瘤衰老過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的回收利用。

圖3. DAP-seq鑒定NAC094調(diào)控的靶基因

NAC094的缺失能夠緩解硝酸鹽誘導(dǎo)的豆血紅蛋白的降解，同時(shí)阻斷了根瘤中由硝酸鹽誘導(dǎo)的衰老相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)。這說(shuō)明NAC094對(duì)于衰老相關(guān)基因的表達(dá)至關(guān)重要。對(duì)nlp1、nlp4和nlpl nlp4突變體根瘤進(jìn)行硝酸鹽處理，發(fā)現(xiàn)NLP1/NLP4的缺失，抑制了硝酸鹽誘導(dǎo)的NAC094及其靶基因的表達(dá)。這說(shuō)明NAC094位于NLP1和NLP4的下游。

代謝組學(xué)結(jié)果顯示，在硝酸鹽處理后的野生型根瘤中，多種二肽和核苷酸分子水平升高，而在nac094突變體根瘤中沒有顯著變化。一些磷脂分子在處理后的野生型根瘤中的含量顯著降低，而在nac094突變體根瘤中變化并不明顯。與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，編碼蛋白酶、肽酶、核酸酶以及磷脂酶的相關(guān)基因受硝酸鹽誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)，并在過(guò)表達(dá)NAC094的根瘤中顯著上調(diào)表達(dá)，這些基因可能參與了根瘤衰老過(guò)程中的蛋白、多肽、核酸與磷脂的代謝過(guò)程。

圖4. NAC094參與硝酸鹽誘導(dǎo)根瘤衰老的工作機(jī)制模型

綜上所述，在硝酸鹽誘導(dǎo)的根瘤衰老過(guò)程中，NAC094正調(diào)控根瘤衰老，位于NLP1/NLP4的下游，通過(guò)激活衰老相關(guān)基因參與調(diào)控硝酸鹽誘導(dǎo)的根瘤衰老過(guò)程。這些衰老相關(guān)基因參與細(xì)胞裂解、蛋白與核酸水解。該研究利用多組學(xué)數(shù)據(jù)，闡明了根瘤衰老的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和物質(zhì)代謝途徑。

原文：Wang L, Tian T, Liang J, Li R, Xin X, Qi Y, Zhou Y, Fan Q, Ning G, Becana M, Duanmu D. A transcription factor of the NAC family regulates nitrate-induced legume nodule senescence. New Phytol. 2023 Mar 22. doi: 10.1111/nph.18896.