PCR檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)反應(yīng)步驟

反應(yīng)步驟：

1、變性：利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA解螺旋，高溫使兩條DNA鏈間的氫鍵斷裂。在第一個(gè)循環(huán)之前，通常加熱時(shí)間較長(zhǎng)以確保模板DNA全分離，僅以單鏈形式存在。該步驟時(shí)間1-2分鐘，接下來(lái)機(jī)器就控制溫度進(jìn)入循環(huán)階段。

2、退火：將反應(yīng)溫度降低至50-65℃（通常比引物 值低3-5℃）持續(xù)20-40s，從而使引物結(jié)合于單鏈DNA上。若退火溫度過(guò)低，容易造成非特異擴(kuò)增，而退火溫度過(guò)高，引物可能根本不結(jié)合。

3、延伸：此步驟的溫度取決于所用的DNA聚合酶。 Taq（Thermus aquaticus）聚合酶的熱穩(wěn)定DNA聚合酶的最佳活性溫度約為75–80°C，但通常使用的延伸溫度為72°C。 在這一步驟中，DNA聚合酶通過(guò)從反應(yīng)體系中添加的5'至3'方向的游離dNTP，從而合成與DNA模板鏈互補(bǔ)的新DNA鏈。延伸所需的精確時(shí)間取決于所用的DNA聚合酶和待擴(kuò)增的DNA片段的長(zhǎng)度。 傳統(tǒng)的Taq 酶估計(jì)合成1000bp大概需要1分鐘、較新的Tbr 酶（來(lái)自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40s、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15s。有修正功能的則會(huì)比較慢。

上述循環(huán)結(jié)束后，將進(jìn)入終延伸階段：此步驟是可選的，但要在70-74°C）（PCR中使用的大多數(shù)聚合酶最佳活性所需的溫度范圍）下進(jìn)行5-15分鐘。 最后一個(gè)PCR循環(huán)，以確保所有剩余的單鏈DNA的岡崎片段被補(bǔ)齊。

最終保持：最后一步將PCR儀反應(yīng)室無(wú)限期地冷卻至4–15°C，可用于PCR產(chǎn)物的短期保存。