定性檢測目的蛋白時細胞樣品制備

  原始樣品可為細胞、組織、培養上清、免疫沉淀或親和純化的蛋白，以下為定性檢測目的蛋白時細胞樣品的處理方法，其余的樣品制備方法參閱相關文獻。

1．培養細胞或藥物處理。

2．棄培養基，用1X PBS漂洗細胞2次，去盡殘留培養基。

3．加入1X SDS樣品緩沖液(6-well plate, 100 μl /w或 75 cm2 plate, 500-1000 μl/瓶)，刮落細胞，轉移到Ep管。注意：冰上操作。

4．超聲 10~15秒剪切DNA以減低樣品粘性。

5．煮沸樣品5 minutes。

6．離心 12000g, 5 min，取上清。

7．電泳分離：上樣15μl~20 μl 至 SDS-PAGE 膠 ( 10 cm x 10 cm)電泳。
如要定量檢測某蛋白的表達水平，應用RIPA裂解液(1 ml per 107 cells/ 100 mm dish/ 150 cm2 flask)裂解細胞，收集裂解液至離心管中，在振蕩器上混勻4～15min， 14000g離心15min（ 4℃），棄沉淀，用Bradford法或其它蛋白質測定方法測定上清中蛋白濃度以調整上樣體積和上樣量，進行Western雜交時還需設置內或外參照，通常用beta-actin。

注意：一般上樣20~30 μg已足夠，如待檢蛋白為低豐度蛋白，可加大上樣量至100μg，但電泳條帶易拖尾，可制備亞細胞組份或采用更敏感的檢測方法。