淺析qPCR反應中的Ct值

     閾值循環數 Threshold cycle (Ct) 也寫作Cq值，熒光信號大于熒光閾值時PCR循環數。儀器軟件通常將第3-15個循環的熒光值設為基線（baseline），是由于測量的偶然誤差引起的。閾值（threshold）一般是基線的標準偏差的10倍。在實際操作中也可以手動調節。高于閾值的熒光信號被認為是真實的信號，用于定義Ct值。Ct會受到閾值的影響，每次試驗由于樣品和儀器的不同會導致基線不同，進而影響閾值和Ct值。

模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在一定線性關系,起始模板量濃度越高，Ct值越小；起始模板量濃度越低，Ct值越大。PCR循環在到達Ct值所在的循環數時，剛剛進入真正的指數擴增期（對數期），此時微小誤差尚未放大，Ct值的重現性較好，即相同含量的初始模板，得到的Ct值是相對穩定的。

Ct值不是恒定不變的，可以受到不同樣品、不同儀器的影響，即使相同的樣品在相同的儀器上重復2遍，Ct值也會存在差異。

1、與Ct值有關的參數

標準曲線Standard curve：模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代Ct值。

相關系數Correlation coefficient (R^2) ：反映了標準曲線的線性，通常要求>0.99。

擴增效率Efficiency (E):通常要求在90%~110%。效率低于100%，是由于PCR反應中存在抑制因素；而高于100%可能一些污染、非特異性擴增或者是引物二聚體造成。

斜率Slope ：當擴增效率為100%時斜率為-3.32，當90%-110%時的斜率為-3.58 ~ -3.10。

2、Ct值與模板拷貝數的關系

理想情況下，qPCR的模板經過一定的循環數進行指數擴增，擴增循環數和產物量之間的關系是：擴增產物量Cn=起始模板量C1×（1+擴增效率E）^循環數n。但是由于E通常無法達到100%，并且在擴增的后期，擴增效率會逐漸降低，只有在理想的情況下才滿足Cn=C1×2^n，即Ct值差1，初始濃度差2倍。

由于Ct值與起始模板的對數存在線性關系，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定。這是目前的qPCR定量的方法，即用已知濃度的標準品與未知濃度樣品同時擴增，將未知濃度樣品的Ct值代入該標準曲線獲得未知樣品濃度。分析定量時，一般取Ct:15-35。太大或者太小都會導致定量結果的不準確。標準曲線需滿足：E：90%~110%，R^2≥0.99，斜率-3.58 ~ -3.10。同時定量標準品的量值需要準確可靠。用qPCR進行定量，理論上可行，實際上很難獲得準確的定量結果。