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    PCR反應循環參數

    時間:2022/3/15閱讀:426
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    PCR反應循環參數:
    1.預變性
    模板DNA*變性與PCR酶的*激活對PCR能否成功至關重要,建議加熱時間參考試劑說明書,一般未修飾的Taq酶激活時間為兩分鐘。
    2.變性步驟
    循環中一般95℃,30秒足以使各種靶DNA序列*變性,可能的情況下可縮短該步驟時間。變性時間過長損害酶活性,過短靶序列變性不*,易造成擴增失敗。
    3.引物退火
    退火溫度需要從多方面去決定,一般根據引物的Tm值為參考,根據擴增的長度適當下調作為退火溫度。然后在此次實驗基礎上做出預估。退火溫度對PCR的特異性有較大影響。
    4.引物延伸
    引物延伸一般在72℃進行(Taq酶最適溫度)。但在擴增長度較短且退火溫度較高時,本步驟可省略延伸時間隨擴增片段長短而定,一般推薦在1000bp以上,含Pfu及其衍生物的衍生設定為1min/kbp。
    5.循環數
    大多數PCR含25-35循環,過多易產生非特異擴增。
    6.最后延伸
    在最后一個循環后,反應在72℃維持10-30分鐘.使引物延伸*,并使單鏈產物退火成雙鏈。


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