蛋白質280nm/254nm雙波長測定：
蛋白質分子中含有共軛雙鍵的、等芳香族氨基酸。它們具有吸收紫外光的性質，其吸收高峰在280nm波長處，且在此波長內吸收峰的光密度值與其濃度成正比關系，故可作為蛋白質定性、定量測定的依據，正因為如此，280nm處的紫外吸收法通常被用于層析系統中蛋白質濃度的連續監控。但由于各種蛋白質的和的含量不同，故要準確定量，必需要有待測蛋白質的純品作為標準來比較，或且已經知道其消光系數作為參考。另外，不少非蛋白物質在280nm波長下也有-定吸收能力，可能發生干擾。其中尤以核酸（嘌呤和嘧啶堿）的影響更為嚴重。在280nm處的吸收比蛋白質強10倍（每克），但核酸在254nm處的吸收更強，其吸收高峰在254nm附近。核酸254nm處的消光系數是280nm處的2倍，
而蛋白質則相反，280nm紫外吸收值大于254nm的吸收值。
通常：
純蛋白質的光吸收比值：A280/A254》1.8
純核酸的光吸收比值：A280/A254《0.5
因此蛋白質溶液中同時存在核酸時（生物體系大多數如此），必須同時測定OD254nm，與OD280nm。然后根據兩種波長的吸收度的比值，通過經驗公式校正，以消除核酸的影響而推算出蛋白質的真實含量。
蛋白質濃度=1.45×A280－0.74×A254（mg/ml）
此經驗公式是通過一系列已知不同濃度比例的蛋白質（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混合液所測定的數據來建立的。
