本試劑盒采用競爭酶標免疫法定量測定尿、肌肉，肝臟及飼料中的克倫特羅及其他β。試劑盒中包括了96個試驗孔包括標準試驗及所有檢測用的試劑。如果進行定量分析，必須有微孔板酶標儀。
概要
克侖特羅（clenbuterol，CLE）是一種腎上腺受體激動劑即神經，在臨床上用于治療支氣管哮喘、慢性支氣管炎和肺氣腫等疾病，因此藥可以提高瘦肉率，減少脂肪沉積和促進動物生長，被一些畜牧養殖企業作為養殖促進劑非法使用。其殘留量可導致人體肌肉震顫、心悸、神經過敏、頭痛、目眩、惡心、嘔吐、發燒、戰栗等癥狀，對消費者的健康極有危害。現已被明令禁止用于養殖業。HPLC或GC-MS一直用作檢測β的方法，但是其前處理步驟費用昂貴。酶聯免疫檢測試劑盒則可經濟、快速地檢測尿，肌肉，肝臟及飼料中的CLE。
測定原理
測定的基礎是抗原抗體反應。微孔板包被有針對CLE的兔抗體。經過洗滌步驟后，加入CLE酶標記物，標準或樣品溶液。CLE與CLE-酶標記物競爭抗體，沒有連接的CLE-酶標記物在洗滌步驟中被除去。將酶反應底物（過氧化尿素）和顯色劑（四甲基聯苯胺）加入到孔中并且孵育。結合的酶標記物將無色的顯色劑轉化為藍色的產物。加入反應停止液后使顏色由藍轉變為黃色。在450nm處測量，吸收光強度與樣品中的CLE濃度成反比。
提供的試劑（2-8℃保存）切勿冷凍
每一個盒中的試劑足夠進行96個測量（包括標準分析孔），盒中的材料如下：
1×96孔板（12條×8孔）包被有兔IgG抗體
6×標準液， (2ml)為分別含0, 0.1, 0.3, 0.9, 2.7, 8.1ppb 的CLE水溶液
1×CLE過氧化物酶標記物濃縮溶液
1×酶反應底物 （6ml）；含有過氧化尿素
1×顯色劑 （6ml）;四甲基聯苯胺
1×反應停止液 （7ml）；1M 硫酸
1×PBS (10ml), 用于稀釋CLE-過氧化物酶標記物濃縮溶液
1×PBST濃縮液(40ml)，加800ml蒸餾水稀釋，洗板用
樣品處理
樣品處理方法1
組織、肉樣（純精肉）、內臟樣品的處理方法:
１．稱2克勻漿過的樣品加入2 mL溶液１(無色無味)，攪拌或震蕩樣品，使之混合均勻。
2. 加入6 ml溶液2(淡黃色,具刺激性氣味)，*用干凈的衛生筷或竹簽攪拌樣品5分鐘；或振蕩15分鐘，使其均勻分布于溶液中。
3．3000g離心10分鐘。
4. 取3ml上清液于干凈平皿中,60℃恒溫箱蒸干(30分鐘左右)；也可在試管中直接水浴加熱蒸干。
5．殘留物用1ml 溶液2 (無色無味) 沖洗溶解。
6．3000g離心10分鐘。
7．取清亮中間部分50ul直接加樣, ELISA進行分析。
注：如果不慎將溶液弄到皮膚上，請立即用７５％的科研酒精棉花擦拭，并用清水沖洗。切勿飲用及濺入眼睛。
樣品處理方法2 （更快速）
1、稱2克勻漿過的樣品加入2 mL溶液１(無色無味)，攪拌或震蕩樣品，使之混合均勻。
2、加入4mL溶液2 (淡黃色,具刺激性氣味)，強烈振蕩，肉樣約2分鐘，組織約6分鐘。
3、3000g離心5分鐘。
4、取1 ml上清液于干凈平皿中，70℃~80℃恒溫箱蒸干(約需5分鐘左右)。或用電吹風，只需3分鐘。
5、殘留物用0.5 ml 溶液3 (無色無味) 沖洗，將底部白色殘留物全部洗入溶液。
6、取洗脫液50ul作檢測用。
酶標免疫分析程序
1. 測定之前注意事項
a) 使用之前將所有試劑回升至室溫20-25℃
b) 使用之后立即將所有試劑放回2-8℃
c) 在使用中不要讓微孔干燥
d) 在ELA分析中的重復性，很大程度上取決于洗板的一致性，仔細按照*的洗板順序操作是ELA測定程序中的要點
e) 在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋子蓋住微孔板
2.酶標記物與微孔板條
a) CLE- 酶標記物 提供的CLE- 酶標記物為濃縮液。由于稀釋的酶標記物穩定性不好，所以只稀釋實際需用量的酶標記物1：14稀釋（1μl酶標液加14μlPBS）。在吸取濃縮液之前，要仔細地振搖，剩余的仍放置2-8℃保存。
b)微孔板條 取出需用數量的微孔板及框架，將不用的微孔板用膠帶封好，放進原袋中重新密封，4℃或-20℃保存，謹防受潮。
3. 標準液 提供的CLE標準液濃度為0, 0.1, 0.3, 0.9, 2.7, 8.1ppb(ng/ml)
4. 測定程序（室溫25℃條件下操作）
a) 剪開鋁箔袋，將足夠標準和樣品所用數量的孔條插入微孔架，標準和樣品做兩個平行實驗，記錄下標準和樣品的位置。加入20μl的標準液或處理好的樣品到各自的微孔中。如果微孔板條一次實驗用不完，放回原鋁箔袋中封緊，再套一個塑料自封袋夾緊后4℃或-20℃保存，切忌受潮。
b) 加入100μl稀釋的酶標記物到微孔底部，25℃孵育30分鐘（*使用恒溫箱）。
c) 倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打（每行拍打3次）以保證*除去孔中的液體，用250μl PBST充入孔中，再次倒掉微孔中液體，再重復操作兩次。每次洗板應加入洗液后等2分鐘再倒掉。*使用洗瓶洗板，這樣可加快速度，避免板條間的孵育時間不一致而產生OD值的差異。
d) 反應底物與顯色試劑以1：1混合后加入100μl到微孔中，充分混合并在25℃暗處孵育15分鐘。
e) 加入50μl反應停止液到微孔中，混合好在450nm 處測量吸光度值，必須在加入停止液后10分鐘內讀取光度值。
結果
所獲得的標準和樣品吸光度值的平均值除以*個標準（0標準）的吸光度值再乘以100，因此0標準等于*并且以百分比的形式給出吸光度值。
標準的吸光度值（或樣品）
----------------------- ×100 = %吸光度值
0標準的吸光度值
計算的標準值繪成為一個對應CLE濃度（ng/g,或ng/ml）的半對數坐標系統曲線圖，校正曲線在0.2-2ng/g(ppb)范圍內應當成為線性。相對應每一個樣品的濃度（ng/g, 或ng/ml）可以從校正曲線上讀出。
靈敏度
克倫特羅測定試劑盒的平均檢測下限約為0.1ng/g（0.1ppb）。
特異性
與克倫特羅類似物的交叉反應：
克倫特羅(Clenbuterol) *
溴布特羅(brombuterol) 110%
塞布特羅(cimbuterol ) 40%
馬噴特羅(mapenterol) 17%
馬布特羅(mabuterol) 16%
*(salbutamol) 9%
妥布特羅(tulobuterol) 2% 特布他林(terbutalin) 2%
萊克多巴胺 <1%
異丙腎上腺素(Isoproterenol) <1%
腎上腺素(Adrenalin ) <1%
*(Noradrenalin) <1%
回收率
回收率為90%±15%
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