HiFi One-Step RT-PCR Mix(電泳)

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產品介紹：

HiFi One-Step RT-PCR Mix(電泳)

末端轉移酶（TdT）是一種不依賴于模板的 DNA 聚 合酶，催化脫氧核苷酸結合到 DNA 分子的 3’羥基端。帶有 突出、凹陷或平滑末端的單雙鏈 DNA 分子均可作為 TdT 的 底物，加尾長度可達 5~300nt。本酶經電子重構架技術篩選， 使其可以在 45°C 高溫下反應，從而避免因 DNA 二級結構造 成的加尾效率下降。 該酶廣泛用于 DNA 的 3’末端添加同聚物、利用修飾堿 基（如 ddNTP，DIGdUTP）標記 DNA 3’末端、TdT 介導的 dUTP 缺口末端標記技術（細胞凋亡的原位檢測）等試驗。

活性定義：37 ℃ 60 分鐘內，催化 1nmol dNTP 加入到多聚核苷酸 3’羥基末端中所需的酶量定義為 1 個活性單位
熱失活：75°C 20min。
儲存：-20℃ 可保存 3 年。
注意事項
1、適量 EDTA 可使 Terminal Transferase 的活性喪失。
2、金屬離子螯合劑，較高濃度的銨根離子、氯離子、碘例子和磷酸根離子均對 Terminal Transferase 活性具有抑制作用。
3、DNA 末端 mol 數的計算，長度為 100bp 的 DNA：1pmol末端 DNA=0.33ng。

本試劑采用穩定高效的 RT-PCR 預混體系，是以 RNA 為模板進行一步法 RT-PCR 的專用試劑。其原理為用基因特 異性引物進行反轉錄反應，獲得第一鏈 cDNA（不可使用 Oligo（dT）或 Random Rimer 合成第一鏈 cDNA），再使 用基因特異性正向引物和反向引物進行 PCR 擴增，在同一 反應體系中一步完成從反轉錄到 PCR 的全部過程。反應體 系中已含有電泳所需的指試劑（藍色和黃色），反應后可以 直接進行電泳。 在本試劑盒中，將耐熱 M-MLV 反轉錄酶、Rnase Inhibitor、 Hotstart 高 保 真 DNA 聚合酶以及穩定劑等配制成 50×One-Step Enzyme Mix 預混液；反應 Buffer、dNTP 以及 電泳指示染料配制成 5×HiFi One-Step RT-PCR Buffer，因此 使得操作更加簡單便，擴增產物可用于平端克隆和 DNA 測 序。
主要優勢：
? 耐熱M-MLV反轉錄酶可在55℃反應能更好的打開復雜二級結構，只需 10min 即可完成逆轉錄。
? DNA 聚合酶為熱啟動型高保真酶，能夠有效的抑制非特異性反應且具有較高的校正活性，酶激活僅需 2min。
? 具有寬泛的模板量兼容性，10 ng~1μg 都可有效擴增。
? 反應過程中無需開蓋，避免了操作過程中的污染危害。
組分
名稱 250T
50×One-Step Enzyme Mix 100 μl
5×HiFi One-Step RT-PCR Buffer 1 ml
RNase Free H2O 1 ml×3
儲存：請置于-20°C，可保存 2 年；避免反復凍融。
注意：
1.50×One-Step Enzyme Mix 粘度高，第一次使用之前要離心收集至反應管底部，吸取時應緩慢小心。
2.由于使用了 Hotstart 高保真 DNA 聚合酶，反應配制可在常溫進行，但各組分應-20°C 保存。
實驗操作和反應條件：
1. 按以下組分配制反應液
RNA（病毒 DNA/RNA 樣品直接使用 2~10μl） 10 ng~1 μg
5×HiFi One-Step RT-PCR Buffer 4 μl
50×HiFi One-Step RT-PCR Enzyme Mix 0.4 μl
基因特異性上游引物（10μM） 0.8 μl
基因特異性下游引物（10μM） 0.8 μl
Rnase Free H2O Up to 20 μl
注意：超過 1 μg 的 RNA 模板量會抑制 PCR 反應，建議第一次可使用 200 ng 的 RNA 模板，然后根據結果進行優化。
2. 在 PCR 儀上按以下條件進行 RT-PCR 反應:
55°C， 10min 逆轉錄反應
95°C， 2min 失活 M-MLV，并激活高保真聚合酶
95°C， 20s 30~40 cycles
TM°C， 20s
72°C ，
2Kb/min
72°C， 2min 末端延伸
3. PCR 反應結束后，可取 5 μl 產物直接進行電泳檢測。預混液中已經包含綠色染料，無需再加入 DNA Loading Buffer。1% Agarose 電泳時，藍色指示劑指示 3~5 kb，黃色指示劑指示<50 bp。

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