T4 UvsX Recombinase

公司產品僅供科研研究使用、不得用于臨床診斷！

產品介紹：

T4 UvsX Recombinase

描述:

UvsX 重組酶，來源于 T4 噬菌體，是 RecA/Rad51家族的同源體。RecA/Rad51 重組酶家族在雙鏈 DNA 斷裂的無誤修復和復制叉重新啟動的過程中起到重要作用。
T4 UvsX 重組酶可與其他重組酶一起錨定在單鏈 DNA 上并激活其在其他雙鏈 DNA 上尋找同源序列，以進一步完成鏈置換。經檢測，該酶無核酸酶活性。

儲存：

置于-20°C 可保存 1 年，-80°C 長期保存，短期使用置于 4°C，保存一個月，避免反復凍融。
熱失活：60°C，10min。
酶儲存液：50 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0.1 mM
EDTA, 10% Trehalose, pH 7.5。2xRPA BufferMix：包含反應緩沖鹽、ATP、磷酸肌酸、dNTP、PEG、DTT、BSA 等，可用于 RPA 擴增試驗。該試劑 4°C
條件下放置 1 個月性能無下降。
基于本蛋白進行 RPA 反應測試的全套試劑

用于 RPA 擴增的測試引物與探針
CPV-F（20uM） CACTTACTAAGAACAGGTGATGAATTTGCTACAG
CPV-R（20uM） AGTTTGTATTTCCCATTTGAGTTACACCACGTCT
Probe（10uM） CCTCAAGCTGAAGGAGGTACTAACTTTGGT[dT-BHQ1]
[THF][dT-FAM]ATAGGAGTTCAACAAG -(C3)
Canine parvovirus type 2,VP2
加入 1μl 的模板 DNA，上機反應前加入 1.25 μl 的 280 mMMg(OAC)2（終濃度 14 mM），總反應體積 25 μl。混合均勻，并離心，置于 39-42℃條件下反應 30min。
2. 進行熒光 RPA 擴增在進行熒光檢測時體系中，額外加入 0.3 μl 的 10μM Probe（120 nM的終濃度）和 50U 的 Exonuclease III（2U/μl 的終濃度），即可進行熒光檢測。本方法應用原理為 ExoIII 切割 THF 位點，使熒光與猝滅基團分離，報告熒光信號。
特別說明：
（1） 以上 RPA 擴增測試屬于蛋白功能性測試，按照以上實驗操作流程，可獲得 RPA 擴增產物。進一步的優化，包括：X、Y、GP32、聚合酶、反應 Buffer，甚至加樣順序，均可能進一步提高 RPA 的擴增性能。
（2）關于 DNA 聚合酶的選擇， 測試了三種常見的 DNA聚合酶，在進行熒光法測定時，推薦的選擇順序依次為 Bst 4.0>Bsu> Sau，且在 42℃條件下，總能獲得最快的擴增速度，且熒光信號更強。在 Basic 擴增中 Sau 表現出特異性擴增能力更佳。
（3）關于 RPA 的靈敏度與非特異擴增，在 Basic 試劑的擴增中，仍然存在非特異擴增產物，這需要進一步優化反應組分及引物序列。在使用熒光探針法時，但由于特異性探針的存在，非特異擴增產物通常無熒光信號值，但此時會影響檢測靈敏度。GP32 蛋白的
濃度增加會顯著降低非特異性擴增，但會導致擴增速度減緩，此時需要同步增加 X 與 Y 蛋白的用量，以維持 RPA 的擴增速度。
（4）據文獻報道，在進行試紙條 RPA 實驗時，傾向使用 Nfo 內切酶又名 Endonuclease IV， 來對擴增探針進行切割，但  未予測試，目前無法提供相應參數。
（5）RPA 反應 Buffer 對擴增至關重要，輕微的濃度差異，均可導致擴增效率大幅下降，甚至失敗。RPA BufferMix 為粘稠試劑，使用時務必保證加樣準確，Tip 頭中的殘液務必打入 EP 管中。

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